葡 萄 孢 属 (BotrytisPers.exFr.) 有 415 个种（亚种、变种和专化型），而灰葡萄孢(B.cinereaPers.) 是该属的一个种，其有性世代为富克尔葡萄孢盘菌[Botryotinia fuckeliana(deBary)Whetzel]。它是多种植物病害的病原菌，因此对葡萄孢属真菌的分类鉴定具有非常重要的理论研究和实际应用价值。多年来，许多真菌分类学家一直致力于不断提高葡萄孢属真菌的分类水平，2008 年已完成了灰葡萄孢菌的全基因组测序，Staatsetal.(2005) 在分子水平上证明了葡萄孢属真菌与寄主的进化关系[1] 。张静 (2010) 利用形态学和分子系统学分析方法对湖北省重要经济作物上 [ 蚕豆 (Vicia faba)、大蒜 (Allium sativum)、洋葱 (Allium cepa)] 的葡萄孢属 11 种真菌进行了分离和鉴定，通过 ITS和 G3PDH 基因序列很好的解决葡萄孢属真菌及其近缘属真菌的系统发育问题，探讨了灰葡萄孢的多样性和抗药性[2] 。近期研究证明，灰葡萄孢真菌携带的线粒体病毒 (mitovirus1，BcMV1) 和核糖核酸病毒 (RNAvirus1,BpRV1)与灰葡萄孢致病力的衰退有密切关系，BcMV1可以通过灰葡萄孢的分生孢子进行垂直传染或通过菌丝的融合进行水平传染，被成功传染BcMV1dsRNA 的菌株会在生长速度和致病力上出现明显的衰退[3] 。

灰葡萄孢能引起 140 余种草本和木本植物的灰霉病[4-10] ，分布广泛，已成为世界性病害，也是我国温室蔬菜、瓜果、草莓、花卉等最主要病害，造成减产 20% ～ 25%, 严重时可达40% 以上[11-12] 。但在紫皮石斛和石斛类植物尚未见灰葡萄孢报道。

本次共分离 314 块染病、健康组织和 50个叶锈病的夏孢子堆，得到 306 个真菌菌落，经鉴定隶属于半知菌亚门，丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科的 6 属 7 种真菌，其中灰葡萄孢 (B.cinerea) 出现数量最多，占 23.4%；其 次 是 绿 色 木 霉 (Trichoderma viride Pers.ExFr.) 占 15.7%； 芽 枝 状 枝 孢 [Cladosporium

cladosporioides(Fries) de Vries] 占 7.4%，尖孢镰刀菌(F.oxysporum Schl.)和三隔镰孢[F.tricinctum(Corda) Sacc.] 占 12.4%( 分别占 6.8% 和 5.6%)；球黑孢 [Nigrospora sphaerica(Sacc.)Mason] 和黑曲 霉 (Aspergillus nigerv.Tiegh) 分 别 占 3.3% 和2.7%；细菌占 15.9%，一些没有产生孢子的真菌未作鉴定。

灰 葡 萄 [Botrytis cinerea Pers.,Ann.Bot.(Usteri),1:32(1794) [5,8-9] MycoBank No.MB217312]

有性态：富克尔葡萄孢盘菌 Botryotiniafuckeliana (de Bary) Whetzel,Mycologia,37(6):679(1945)

分类地位隶属于真菌界(KingdomFungi)， 真菌门(Eumycota)，半知菌亚门(Deuteromycotina),丝孢纲 (Hyphomycetes)，丛梗孢目 (Moniliales)，丛梗孢科 (Moniliaceae)，葡萄孢属 (Botrytis) 的灰葡萄孢（Botrytis cinerea）。

（2）形态特征分生孢子梗着生于菌丝上， 在分生孢子梗基部与菌丝之间会产生横膈膜（图1-b），群生或单生(135 ～ )270 ～ 1500µm×12.5 ～ 22.5µm，不分枝或分枝，直立，有横膈，分枝处稍有缢缩现象，分生孢子梗顶端细胞膨大，其上着生小梗 ( 图 1-a、b），无色或淡色；分生孢子着生于分生孢子梗分枝顶端膨大的小梗上，聚生呈葡萄状，单细胞，无色至淡褐色，成堆时淡黄色，圆形、椭圆形、卵圆形等多种形状 ( 图 2-a-j）；有的基部宽，烧瓶状 ( 图2a）；部分孢子常具有突起的脐（图 2c），表面光滑，9.6 ～ 18.7µm×6.6 ～ 10.4µm，平均12.5×7.8µm。在同一根分生孢子梗上产生的分生孢子形状相似 ( 图 3)；有的分生孢子表面有 2-3 条裂缝 ( 图 4a-b)；极少数分生孢子双细胞，两个细胞等大或不等大 ( 图 5a-b)，大小为20 ～ 27µm×8.6 ～ 9.4µm。有的分生孢子萌发时会产生分隔，变成双细胞，芽管可在孢子顶端中间或顶端侧面 ( 图 6a-b)；分生孢子长 / 宽比为 1.55。

通过对灰葡萄孢菌丝的 DNA 提取，用ITS1 和 ITS4 的通用引物进行 PCR 扩增，得到长度为 541bp 的特异性 DNA 片段。扩增 ITS 区全序列 ( 图 7)，对扩增片段进行测序，用 NCBI的 Blast 在 Genbank 中搜寻相似序列，结果与Genbank 中登陆号为 JX875916.1，JX840481.1，HM849615.1 和 HM849047.1（包括 18S 核糖体RNA 基因的部分序列 ; 内转录间隔区 1，5.8S核糖体 RNA 基因全序列，内转录间隔区 2 全序列和 28S 核糖体 RNA 基因部分序列）的同源性为 100%，因此，确定分离到的紫皮石斛上的菌株为富克尔葡萄孢盘菌 [Botryotinia fuckeliana(deBary) Whetzel]（无性态：Botrytiscinerea）。

2.4.1 绿 色 木 霉 [TrichodermaviridePers.,NeuesMag.Bot.1:92(1794) [4,7-8] MycoBankNo.MB181950]

绿色木霉与哈茨木霉 (T.harzianum) 的颜色和生长速度相似， 二者都是植物病害的生防菌，区别在于绿色木霉小梗呈对生分枝，而哈茨木霉小梗呈轮生分枝；哈茨木霉分生孢子更小，1.2 ～３.1×1.5 ～４.1µm [16] 。

2.4.2 芽 枝 状 枝 孢 [Cladosporiumcladosporioides (Fresen.) G.A.deVries,Contrib.Knowledge of the Genus Cladosporium link exFries:57(1952) [17] MycoBank No.MB351984]

在 25±1 ℃ 的 PDA 上 培 养 7d， 菌 落 粉状，橄榄绿色，反面黑绿色，平铺，日生长量2mm。菌丝褐色，有分隔，直径 4.8 ～ 13.3µm。分生孢子梗多侧生在菌丝上，不分枝，分隔处不缢缩，直立，单胞后不再伸长，不膨大，淡褐色，具孢痕，80.2 ～ 340.8µm×2.6 ～ 5.5µm。枝孢0 ～ 1 个隔膜，15.2 ～ 26.1µm×2.9 ～ 5.8µm。分生孢子顶生或侧生，形成分枝的孢子链，椭圆形、圆柱形或近球形，淡褐色，大多数为单细胞， 极少数为双细胞， 3.5～15.5×2.7～5.6µm。

芽 枝 状 枝 孢 与 瓜 枝 孢 和 球 状 枝 孢(C.sphaerospermum)相似，但瓜枝孢的孢子较长，5.4 ～ 22µm，寄生于葫芦科 (Cucurbitaceae) 植物上，球枝孢的分生孢子球状，3 ～ 4.5µm，均与本种易于区别[17] 。

2.4.3 尖 孢 镰 刀 菌 [Fusarium oxysporumE.F.Sm.&Swingle [7,18-19] MycoBank No.MB416242]

在 25±1℃的 PDA 上气生菌丝白色 , 粉色 ,丝绒状 , 培养基表面无色或淡紫色 ; 菌落背面粉色或紫色，日生长量 11mm；产孢细胞瓶梗状，单生或具分枝，5 ～ 35µm×2.5 ～ 4.5µm；小型分生孢子 1 ～ 2 个细胞 , 卵圆形或肾形，散生于菌丝间，4.8 ～ 24.5µm×2.3 ～ 5.2µm;大型分生孢子纺锤形至镰刀形，弯曲或端直， 基 部 有 足 细 胞 或 近 似 足 细 胞，3 个 隔膜，20.5 ～ 57.7µm×2.5 ～ 6.2µm；5 个 隔 膜30.5 ～ 57.7µm×3.5 ～ 5.2µm；厚垣孢子间生或顶生，球形或椭圆形，直径 6.5 ～ 16.2µm。在PDA上培养2周未见产生浅黄色分生孢子堆。

尖孢镰刀菌与三隔镰孢 [F.tricinctum(Corda)Sacc.] 的 培 养 形 状、 生 长 速 度、 分 生 孢 子梗和小型分生孢子大小基本相似，区别在于三隔镰孢的 3 个隔膜大分生孢子更小，24.5 ～ 37.2µm×3.4 ～ 5.2µm [18,20] 。

在紫皮石斛上共分离到 306 个真菌菌落，鉴定隶属于半知菌亚门、丝孢纲、丛梗孢目、丛梗孢科的 6 属 7 种。灰葡萄孢、绿色木霉、镰刀菌占和芽枝状枝孢占真菌菌落总数的58.9%，其中灰葡萄孢分占 23.4%，并普遍存在于紫皮石斛的各个器官上。细菌占 15.9%。

根据灰葡萄孢的培养性状、分生孢子梗和分生孢子的形态特征，该菌与资料记载基本相符；但是，有些形态特征，如双细胞的分生孢子和分生孢子表面有 2~3 条裂缝在以前的文献中未见描述。分生孢子表面的裂缝类似于子囊菌亚门、座坚壳属(Rosellinia de Not.) 子囊孢子的发芽缝。

葡萄孢属的一些种都有倒卵形的分生孢子，可以明显区别灰葡萄孢 (Botrytiscinerea)，例 如 水 仙 葡 萄 孢 (B.narcissicola) 有 稍 大 一些 的 分 生 孢 子 (8 ～ 16µm×7.5 ～ 1.2µm) 和2 ～ 3mm 的小菌核；拳卷灰葡萄孢 (B.convoluta)具有特别大的分生孢子 ( 可达 16×18µm) 和脑状菌核，生长在鸢尾 (Iris sp.) 植物上；大蒜盲种葡萄孢（B.porri）有较宽的分生孢子(11 ～ 14µm×7 ～ 10µm) 和特别大、不规则菌核 ( 可达 40µm) [8] 。

通过对灰葡萄孢分生孢子结构、菌丝内的脂肪和 DNA 分析研究证明，分生孢子的外壁是电子密集区 , 在分生孢子萌发期间这层壁会破裂，成为无定形层[8,21] ；菌丝里的脂肪酸主要是棕榈酸，油酸 , 亚麻酸，十八碳三烯[22] ；DNA分析显示，遗传信息包括 24.4% 腺嘌呤，25%鸟嘌呤，25.9% 胞嘧啶，24.7% 胸腺嘧啶，或鸟嘌呤和胞嘧啶的总和为 50.9% [8] 。

 [1]Staats N, P Van Baarlen, J A L Van Kan. Molecularphylogeny of the plant pathogenic Botrytis and theevolution of host specificity [J]. Mol. Biol. Evol.2005(22):333-346.

[5]Ellis M B. Dematiaceous hyphomycetis[M].Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, Enland,1971, 178-184.

[7]魏景超. 真菌鉴定手册[M].上海: 上海科学技术出版社,1979, 6.

[8]Domsch Klaus H, Gams Walter, Anderson Traute-Heidi. Compendium of soil fungi [M]. Second edition,Berchtesgadener Anzeiger, Griesstatter, Str. 1, D-83471Berchtesgaden, 2007.

[10]Serfert Keith, Morgan-Jones Gareth, Gams Walter,et al. The genera of Hyphomycetes [M]. CBS-KNAWFungal Biodiversity Centre, Utrecht, The Netherland, 2011.

[11] Williamson B, Tudzynski B, Tudzynski P, etal. Botrytis cinerea: the cause of grey mould disease[J].Molecular Plant Pathology, 2007, 8(5): 561-580.

[13]赵桂华,石立岩,杨怀光,等.杨树内生真菌的分离和鉴定[J]. 南京林业大学学报(自然科学版), 2008,32(2):76-78.

[14]Hawksworth, D.L. Mycologists handbook-Anintroduction to the principles of taxonomy and nomenclaturein the fungi and lichens [M]. Commonwealth MycologicalInstitute, Kew, Surrey, England. 1974.

[15]赵桂华,李德伟. 中国NL351杨树上热带头梗霉Cephaliophora tropica 的首次发现[J]. 西部林业科学,2012, 41(1): 46-52.

[21]Buckly P M,Sjaholm V E, Sommer N F. Electronmicroscopy of Botrytis cinerea conidia [J].. Journal ofBacteriology, 1966(91):2037-2044.

[22]Haskins R H, Micetich R. G,Tulloch A P.Steroids and the stimulation of sexual reproduction ofspecies of Pythium [J].Canadian Journal of Microbiology,1964(10):187-195.